Actividad hepatoprotectora in silico e in vivo del 5 sintetizado

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 4681 (2023) Citar este artículo

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En el presente estudio, se investigó el efecto hepatoprotector de la 5-bencilidina-2-tiohidantoína (5B2T), un derivado único del grupo de las tiohidantoínas, sobre la lesión hepática inducida por dietilnitrosamina (DEN) en ratas macho. Los animales de experimentación se dividieron en tres grupos, cada uno con 14 ratas. Las ratas del grupo I se consideraron controles y recibieron sólo Tween 80 al 10%. A las ratas del grupo II se les inyectó 200 mg/kg de DEN por vía intraperitoneal. A las ratas del grupo III se les inyectó una dosis única de 200 mg/kg de DEN por vía intraperitoneal y recibieron el tratamiento por vía oral (50 mg/kg, 5B2T) durante dos duraciones, 3 y 6 semanas. Al final del experimento, se recolectó sangre para el análisis de la función hepática y los niveles de citocina proinflamatoria IL-6 y factor de necrosis tumoral α (TNF-α). Además, las muestras de hígado se utilizaron para el examen histopatológico y la inmunohistoquímica. La inyección intraperitoneal única de 200 mg/kg de DEN en ratas resultó en una elevación significativa de los niveles de enzimas séricas de AST, ALT y ALP, que son indicadores de daño hepatocelular, junto con una elevación de TNF-α e IL-6 en el grupo DEN. Los resultados de LFT y ELISA en el grupo de tratamiento mostraron mejoras y una disminución en los niveles de los marcadores. El examen histopatológico mostró fibrosis, necrosis e infiltración de células inflamatorias en el grupo DEN, con menor intensidad en el grupo de tratamiento. Los resultados de la tinción inmunohistoquímica revelaron una fuerte tinción positiva de los anticuerpos HSA y Ki-67 en el grupo DEN, con una intensidad mucho menor en el grupo de tratamiento. Los resultados del estudio de acoplamiento indicaron que 5B2T tiene una interacción notable con TNF-α (ID de PDB: 1TNF) e IL-6 humana (ID de PDB: 1IL6) con energías en el sitio de unión de −7,1 y −6,1 (kcal/mol), respectivamente. La correcta absorción y unión entre el fármaco y el receptor se evaluó mediante acoplamiento molecular computarizado utilizando el programa AutoDock. La conclusión de los resultados del estudio actual reflejó las interesantes capacidades hepatoprotectoras de 5B2T contra el daño hepatocelular inducido por DEN y el cáncer en ratas experimentales.

El cáncer de hígado es una de las neoplasias malignas más comunes y críticas en todo el mundo, con un rápido crecimiento y mal pronóstico. El cáncer de hígado puede comenzar como una lesión hepática normal que se convierte en fibrosis y luego puede progresar a cirrosis y terminar en un caso crítico de carcinoma1. El carcinoma hepatocelular (CHC), conocido simplemente como cáncer de hígado, es un tipo de cáncer mortal con altas tasas de morbilidad y mortalidad. Una de las razones por las que el diagnóstico del cáncer de hígado es difícil es por su estado asintomático hasta que alcanza etapas desarrolladas2. El hepatocarcinoma está compuesto por células neoplásicas malignas que en gran medida parecen hepatocitos, las cuales se alteran con la diferenciación3. El hígado es el órgano interno más grande y es responsable de la realización de muchas actividades vitales, por ejemplo, la erradicación de materiales de desecho biológicos internos y externos y desechos metabólicos (p. ej., bilis, urea y lípidos) fuera de la circulación sanguínea. . Además, tiene un papel muy importante en muchas funciones del sistema inmunitario4. Las incidencias de carcinoma hepatocelular están aumentando actualmente tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo debido a las altas tasas de infecciones virales (p. ej., HBV, HCV y HDV), alcoholismo y obesidad5.

Las nitrosaminas son un grupo de compuestos químicos tóxicos que se consideran muy potentes, tóxicos y cancerígenos tanto para humanos como para animales6. Los compuestos de N-nitroso alquilo, específicamente dietilnitrosamina (DEN), pueden iniciar diferentes tipos y etapas de tumores malignos en varios órganos, incluidos el hígado, los pulmones y la sangre, y se usan ampliamente como químicos inductores para promover cánceres en animales de experimentación (más comúnmente ratas) 7. Las dietil nitrosaminas estaban previamente bien establecidas como conservantes para muchos alimentos, como productos lácteos, pescado y carne ahumados y salados, soja y bebidas alcohólicas. En la industria alimentaria, se agregan algunos productos químicos como inhibidores del crecimiento microbiano, materiales conservantes, colorantes y estabilizadores del sabor. Lo más famoso es que se utilizan nitritos. Los nitritos se transforman en nitrosaminas bajo la influencia de las altas temperaturas y los jugos ácidos gástricos, y el resultado neto es que estos tipos de alimentos son una fuente importante de estos materiales tóxicos, razón por la cual estos químicos ya no se utilizan como conservantes en el procesamiento de alimentos8. Las hidantoínas (también conocidas como glicolureas, surgen de la reacción del ácido glicólico y la urea) y sus derivados (y algunas otras moléculas) son un grupo de compuestos heterocíclicos (orgánicos), y se consideran químicos muy importantes y vitales, porque desempeñan un papel fundamental en muchos enfoques biológicos y farmacológicos, así como en la química médica y en aplicaciones agroquímicas, además de estos, representan los precursores clave para la síntesis química y enzimática de muchos alfa aminoácidos no naturales cruciales y sus conjugados de importancia médica. La hidantoína es un sólido incoloro, y es un derivado de la oxidación de la imidazolidina, lleva la fórmula C3H4N2O29. Las tiohidantoínas y sus derivados son foco de interés para científicos e investigadores en la actualidad debido a su alto potencial bioactivo y terapéutico. La tiohidantoína es un análogo de azufre (S, o tio) del compuesto hidantoína (también conocido como imidazolidin-2,4-dionas), en el que uno o dos grupos carbonilo se reemplazan por grupos tiocarbonilo10. Un hecho interesante sobre este grupo de moléculas es que su actividad biológica cambia y se ve afectada según la naturaleza de los sustituyentes. Un número significativo de derivados de tiohidantoína se pueden preparar clásicamente mediante reacciones de condensación de varios aldehídos11,12. Entre las principales aplicaciones biológicas, actividades terapéuticas y propósitos farmacológicos de esta clase de compuestos heterocíclicos se incluyen actividad antitumoral, actividad antibacteriana, actividad antiparasitaria, actividad antipalúdica, actividad antifúngica, actividad antiepiléptica, actividad anti- actividad de melanogénesis10. Es interesante notar el surgimiento del anillo de tiohidantoína como un ingrediente farmacofórico eficaz en el desarrollo de inhibidores potentes para los receptores del factor de crecimiento EGFR y VEGFR. Además, los derivados de la tiohidantoína son antagonistas de los receptores de andrógenos y del factor de necrosis tumoral, así como inhibidores eficaces de varias enzimas, como la ADN topoisomerasa I, II (TopI, II), NOX, isocitrato deshidrogenasa (IDH), linfoma de células B-2 (Bcl- 2) y sirtuinas (SIRT), proteína del huso de cinesina (KSP), prolil hidroxilasas 1–3 (PHD 1–3), CDK2 y CDK4.11,25. El objetivo del presente estudio fue probar el efecto hepatoprotector del nuevo derivado de tiohidantoína 5-bencilidina-2-tiohiadantoína (5B2T) en un modelo de rata de lesión hepática inducida por DEN.

Para el presente estudio, se preparó experimentalmente en el laboratorio un derivado recién sintetizado de la tiohidantoína, 5B2T, y se usó como fármaco para el tratamiento de la lesión hepática.

Todos los puntos de fusión de los compuestos se determinaron en un aparato Griffin. Los espectros infrarrojos se registraron en el rango de 4000–600/cm a través de un instrumento FTIR de la serie SHIMADZU CORP. Los espectros de RMN se realizaron en un espectrómetro Bruker DPX 400 (400 MHz) utilizando tetrametilsilano (TMS) como estándar interno. Los desplazamientos químicos se midieron en ppm (δ) en relación con TMS (0,00) ppm. Los datos espectrométricos de masas de alta resolución se obtuvieron en modo de electropulverización (ES), a menos que se indique lo contrario, en un microespectrómetro de masas Q-TOF de Waters utilizando un muestreador automático Gilson 232XL.

Se colocó 2-tiohidantoína comercialmente disponible con los aldehídos requeridos en un matraz de fondo redondo equipado con un agitador magnético y un condensador de reflujo bajo una atmósfera de nitrógeno en trietilamina y agua. La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente y el pH se ajustó a 3 añadiendo HCl 3 M. El producto sólido se separó por filtración y se lavó con éter dietílico y agua. Los compuestos puros se recogieron y secaron13.

5B2T (el producto final) se sintetizó usando hidantoína disponible comercialmente disuelta en etanol en presencia de benzaldehído y trietilamina y en un reflujo de H2O durante la noche (esto se hizo después del éxito de una reacción de prueba).

Se siguieron las directrices de la OCDE-423 para determinar la seguridad del nuevo compuesto sintetizado 5B2T mediante la administración de una dosis única de 2 g/kg y 5 g/kg a los ratones experimentales14. En resumen, 36 ratones sanos (18 machos y 18 hembras) se dividieron en tres grupos etiquetados como: vehículo (dH2O), dosis baja (2 g/kg) y dosis alta (5 g/kg) de 5B2T, respectivamente. Cada ratón se hizo ayunar una noche antes de la dosificación. Se retuvo la comida durante otras 3-4 h después de la administración. Los animales se observaron de cerca durante 30 min ya las 2, 4, 24 y 48 h después de la administración para detectar cualquier signo de toxicidad clínica aguda, morbilidad y mortalidad. Las observaciones del comportamiento incluyen: respiración (dispenea), salivación, piloerección de la piel, exoftalmos, convulsiones y cambios de locomoción. Después de mantenerse vivos durante 14 días, el día 15, los ratones fueron sacrificados para medir los parámetros bioquímicos séricos (hígado y riñón) siguiendo los métodos estándar15.

En este estudio se utilizaron cuarenta y dos ratas macho adultas sanas que pesaban entre 200 y 250 g con una edad promedio entre 3 y 4 meses. Se obtuvieron de la unidad de alojamiento de animales/Facultad de Farmacia/Universidad Médica Hawler. Los animales recibieron comida estándar y agua del grifo. Los animales fueron manipulados y recibieron atención humana de acuerdo con los principios éticos de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de la Salud16 con el permiso del Comité de Ética de la Facultad de Farmacia/Universidad Médica Hawler (n.º 2021.25.08- 205 HMU.PH.CE). Todos los métodos se informan de acuerdo con las pautas de ARRIVE (https://arriveguidelines.org). Los animales se mantuvieron a 22 ± 3 °C bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h–12 h con 50–60 % de humedad durante al menos una semana antes del experimento. Las ratas se agruparon en tres grupos (n = 12). La administración de la dosis se hizo considerando el peso corporal (BW) de las ratas. Al grupo I se le administró Tween 80 al 10% durante todo el experimento y se consideró como el grupo placebo. Las ratas del grupo II recibieron una inyección intraperitoneal de dosis única de DEN de 200 mg/kg6 siguiendo el método de Rezaie et al.6 y sirvieron como grupo de control positivo para lesiones hepáticas, mientras que las ratas del grupo III recibieron 50 mg/kg de 5B2T por vía oral. tratamiento en dos períodos: el primer período duró 3 semanas y el segundo período duró 6 semanas. Al final del experimento, se sacrificaron todas las ratas y se recolectó sangre para análisis bioquímico y análisis de citoquinas proinflamatorias por ELISA. Los tejidos de los hígados recolectados de las ratas se fijaron con formalina al 10% y luego se sometieron a una serie de reacciones de hidratación y deshidratación. Luego, se incrustaron, seccionaron, procesaron y tiñeron con tinciones de hematoxilina y eosina y se analizaron para la detección de anticuerpos específicos, que fueron proteína nuclear (Ki-67) y antígeno específico de hepatocito (HSA).

Las estructuras bidimensionales (2-D) de las moléculas del ligando (Fig. 1) se construyeron usando chemdraw professional 16.0 y se convirtieron a estructuras tridimensionales (3-D) usando el módulo Chem3D 16.0 y se guardaron como estructuras en formato pdb (http ://www.cambridgesoft.com/). El ligando se optimizó agregando cargas Geister e hidrógeno y el formato pdbqt de los ligandos se preparó con AutoDock Tools 1.5.7.

5-bencilidina-2-tiohidantoína.

Luego, las moléculas de ligando se usaron como entrada para AutoDock Vina (https://vina.scripps.edu/) para llevar a cabo la simulación de acoplamiento.

La estructura cristalina de rayos X del objetivo del factor de necrosis TNF-α (ID de PDB: 1TNF) y la interleucina-6 humana IL-6 (ID de PDB: 1IL6) se recuperaron del servidor web RCSB Protein Data Bank (http:// www.rcsb.org/pdb/). Los sitios de unión activos se identificaron con el visualizador Discovery Studio 2021. Las dimensiones de la cuadrícula se establecieron en 8,41 × 64,05 × 31,20 (ID de PDB: 1TNF) y 3,49 × − 3,45 × 0,44 (ID de PDB: 1IL6) de acuerdo con las coordenadas x, y , y z, para los sitios de unión activos objetivo identificados en el visualizador Discovery Studio 2021. Las moléculas de agua se eliminaron de los receptores y se agregaron cargas polares de hidrógeno y Kollman. El formato pdbqt de los receptores fue generado por AutoDock Tools 1.5.7. AutoDock Vina se compiló y se ejecuta bajo el sistema operativo Windows 10.0 Professional. Discovery Studio 2021 se utilizó para deducir la representación pictórica de la interacción entre los ligandos y la proteína diana.

Se calculó la afinidad de unión (ki) de los ligandos para dianas seleccionadas utilizando la ecuación. (1)

donde \(\Delta G\) es la energía de enlace en kcal/mol, la constante universal de los gases R = 1,987 kcal/K/mol, a temperatura ambiente (25 °C) T = 273 + 25 = 298 K. Ki es la constante de inhibición donde Ki depende principalmente de la constante de unión (o asociación) (Kb) que tiene una unidad de mM17.

La predicción de parámetros farmacocinéticos y fisicoquímicos juega un papel clave en el diseño de fármacos18. La evaluación de las propiedades de similitud con los fármacos se evaluó para 5BT usando SwissADME (http://www.swissadme.ch/) y admetSAR (http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar2).19 La molécula similar a los fármacos debe obedecer la regla de los cinco de Lipinski (RO5): el peso molecular MW del fármaco oral activo debe ser ≤ 500 Da; el log p debe ser < 5; el número de aceptores de enlaces de hidrógeno debe ser nOH ≤ 10; el número de donantes de enlaces de hidrógeno nOHNH debe ser ≤ 5; y el número de bonos giratorios debe ser ≤ 1020.

Utilizando el método de preparación mencionado en la sección de materiales y métodos, se añadieron tiohidantoína (2,0 g, 17,2 mmol), trimetilamina (4,9 ml, 37 mmol) y benzaldehído (1,9 ml, 19 mmol) a 50 ml de agua. Rendimiento = 69,9 %, Pf 270–272 °C, HRMS calculado para C10H8N2OS m/z [M + H] + 204,0358; encontrado 204.0358; 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 12,41 (s, H, NH), δ 12,19 (s, H, NH), δ 7,74 (d, J = 7,4 Hz, 2H, phen), δ 7,45 –7,37 (m, 3H, fenilo), δ 6,49 (s, H, CH=C). RMN 13C (101 MHz, d6-DMSO): δ 177,3 (C=S), δ 164,0 (CO), δ 130,5 (C=CH), δ 128,6 (2xCH), δ 127,3 (C), δ 127,0 (2xCH ), δ 126,0 (CH), δ 109,7 (CH=C). IR (puro): vmax = 3225/cm (NH), 1723 cm-1 (C=O), 1475/cm (C=S), 1643/cm (C=C).

Los ratones experimentales tratados con dosis altas (2 g/kg y 5 g/kg) de 5B2T permanecieron vivos durante 14 días con una condición saludable activa y no hubo signos evidentes de toxicidad ni se registraron casos de muerte. Los resultados obtenidos de las pruebas bioquímicas sanguíneas no demostraron ninguna diferencia entre los grupos tratados y el grupo de control, como se muestra en las Tablas 1 y 2, lo que sugiere que la 5B2T era segura cuando se administraba por vía oral y que la dosis letal (DL50) para ambos sexos era superior a 5 g. /kg.

Los resultados del presente estudio (fig. 2) mostraron que la administración de DEN provocó una elevación significativa de los parámetros bioquímicos en el primer grupo (ratas tratadas con DEN), mientras que el tratamiento con 5B2T provocó una disminución notable de los mismos marcadores bioquímicos. Al mismo tiempo, los resultados de ELISA reflejaron un aumento significativo de citoquinas proinflamatorias (TNF-α e IL-6) en ratas tratadas con DEN y niveles particularmente bajos de las mismas citoquinas en ratas tratadas con 5B2T (Fig. 3).

El efecto de 5B2T en los parámetros bioquímicos del hígado. El eje X presenta los grupos de tratamiento y el eje Y presenta los parámetros de función hepática, DEN: dietilnitrosamina, T: 10% tween 80, 5B2T: grupo de tratamiento. AST: acetato aminotransferasa, ALT: alanina aminotransferasa, ALP: fosfatasa alcalina.

El efecto de 5B2T en los niveles de citocinas proinflamatorias TNF-α e IL-6. El eje X presenta los grupos de tratamiento y el eje Y presenta los niveles de citoquinas, DEN: dietilnitrosamina, T: 10% entre 80, 5B2T: grupo de tratamiento. TNFα: factor de necrosis tumoral alfa e IL-6: Interleucina 6.

El examen histopatológico de las secciones de hígado en las ratas tratadas con placebo (10% Tween 80) mostró características histológicas completamente normales para ambas duraciones (3 semanas y 6 semanas) (Fig. 4A y B). La administración de DEN durante 3 semanas mostró un daño hepático muy notorio, representado por una desfiguración masiva de la estructura hepática, dilatación de los sinusoides y fibrosis masiva alrededor del área porta (Fig. 4C). La administración de DEN durante 6 semanas provocó a su vez características histológicas anormales masivas de las secciones hepáticas, acompañadas de infiltración de células inflamatorias alrededor del área de la vena central, lo que es un indicador de inflamación y etapa avanzada de daño hepático. Además, presentaba dilatación de los canalículos biliares, peliosis hepática y adenoma (fig. 4D). Las ratas tratadas con DEN y 5B2T mostraron mejoras dramáticas en la apariencia histopatológica de las secciones de hígado analizadas para ambas duraciones (3 y 6 semanas) (Fig. 4E y F).

Sección de hígado, H&E. 400×. (A) Grupo placebo/3 semanas, muestra características histológicas normales de cordones hepáticos (flecha negra) y vena central (flecha azul). (B) Grupo placebo/6 semanas, muestra características histológicas normales de vasos sanguíneos en el área portal (flecha negra) y conductos biliares (flecha azul), hepatocitos (flecha roja). (C) Grupo DEN/3 semanas, muestra fibrosis alrededor del área porta (flecha negra), hiperplasia de células de Kupffer (flecha azul) y dilatación de sinusoides (flecha roja). (D) Grupo DEN/6 semanas, muestra adenoma hepatocelular (flecha negra), hiperplasia de células de Kupffer (flecha azul), degeneración vacuolar (flecha roja), necrosis coagulativa (flecha morada), con dilatación de sinusoides (flecha verde). (E) Grupo 5B2T/3 semanas, muestra hiperplasia de conductos biliares (flecha negra), hepatocitos necróticos (flecha azul) e infiltración de células inflamatorias (flecha roja). (F) Grupo 5B2T/6 semanas, presenta peliosis leve (flecha azul) y pocos hepatocitos muestran degeneración celular (flecha roja).

Los cambios inmunohistoquímicos se evaluaron mediante el cribado de la expresión de dos marcadores hepáticos: Ki-67 y HSA. Los hallazgos del grupo placebo (grupo I) mostraron tinción negativa con anticuerpos Ki-67 en el núcleo de los hepatocitos a las 3 y 6 semanas (Fig. 5A y B). Por el contrario, las ratas tratadas con DEN (grupo II) mostraron tinción positiva con anticuerpos Ki-67 en los hepatocitos afectados durante la primera y segunda duración, y los núcleos de las células afectadas se tiñeron de color marrón oscuro (Fig. 5C y D). Las secciones histológicas hepáticas teñidas de ratas tratadas con 5B2T (grupo III) mostraron una tinción positiva débil con anticuerpos Ki-67 en el citoplasma de los hepatocitos afectados como gránulos de color marrón dorado durante la primera duración (3 semanas); por otro lado, las secciones histológicas de rata para la segunda duración (6 semanas) mostraron una tinción positiva débil con anticuerpos Ki-67 en el citoplasma de las células hepáticas lesionadas y una apariencia de gránulos de color marrón dorado (Fig. 5E y F). Además, las secciones de las ratas tratadas con Tween 80 al 10% (grupo I) mostraron tinción negativa con anticuerpos HSA en el citoplasma de los hepatocitos durante la primera y segunda duración (Fig. 6A y B). Las secciones histológicas de las ratas tratadas con DEN (grupo II) mostraron una fuerte tinción positiva con anticuerpos HSA en los hepatocitos afectados, que se tiñeron como gránulos citoplasmáticos de color marrón dorado durante la primera y segunda duración, y los núcleos de las células afectadas se tiñeron de color marrón oscuro (Fig. .6C y D). Las secciones histológicas hepáticas teñidas de las ratas tratadas con 5B2T (grupo III) mostraron una tinción positiva débil con anticuerpos HSA en el citoplasma de los hepatocitos afectados como gránulos de color marrón dorado durante la primera duración del experimento (3 semanas); por otro lado, para la segunda duración (6 semanas), las secciones histológicas revelaron una tinción positiva débil con anticuerpos HSA en el citoplasma de las células hepáticas lesionadas con apariencia de gránulos de color marrón dorado (Fig. 6E y F).

Sección de hígado, IHC Ki67 -ab. 400×. (A) Grupo placebo/3 semanas, muestra tinción negativa con anticuerpos Ki67 en el núcleo de los hepatocitos (flecha roja). (B) Grupo placebo/6 semanas, muestra tinción negativa con anticuerpos Ki67 en el núcleo de los hepatocitos (flecha roja). (C) grupo DEN/ 3 semanas, muestra tinción positiva con anticuerpos Ki67 en los hepatocitos afectados que tiñeron el núcleo de color marrón oscuro (flecha roja), observe tinción inespecífica en otros elementos celulares (flecha negra). (D) grupo DEN/6 semanas, muestra tinción positiva con anticuerpos Ki67 en los hepatocitos afectados que tiñeron el núcleo de color marrón oscuro (flecha roja). (E) Grupo 5B2T/3 semanas, muestra pocos núcleos de hepatocitos con tinción positiva con anticuerpos Ki67 (flecha roja). (F) Grupo 5B2T/6 semanas, muestra núcleo de hepatocitos con tinción negativa con anticuerpos Ki67 (flecha roja).

Sección de hígado, IHC HSA -ab. 400×. (A) Grupo placebo/3 semanas, muestra tinción negativa con anticuerpos HSA en el citoplasma de los hepatocitos (flecha roja). (B) Grupo placebo/ 6 semanas, muestra tinción negativa con anticuerpos HSA en el citoplasma de los hepatocitos (flecha roja). (C) DEN/3 semanas, muestra una fuerte tinción positiva con anticuerpos HSA en los hepatocitos afectados que se tiñeron como gránulos dorados citoplásmicos (flecha roja), observe una tinción inespecífica en otros hepatocitos (flecha negra). (D) grupo DEN/6 semanas, muestra una fuerte tinción positiva con anticuerpos HSA en los hepatocitos afectados que se tiñeron como gránulos dorados citoplásmicos (flecha roja). (E) Grupo 5B2T/3 semanas, muestra poca tinción débilmente positiva con anticuerpos HSA en el citoplasma de los hepatocitos como gránulos de color marrón dorado (flecha roja). (F) Grupo 5B2T/6 semanas, muestra poca tinción débilmente positiva con anticuerpos HSA en el citoplasma de los hepatocitos como gránulos de color marrón dorado (flecha roja).

La correcta absorción y unión entre el fármaco y el receptor se conoce como acoplamiento molecular. La interacción más significativa de un ligando y un receptor tiene la energía de acoplamiento más baja. Se utilizó AutoDock Vina para evaluar la afinidad, la conformación de la unión y el mejor ligando. Para ambos ligandos, entre múltiples poses de acoplamiento, solo se incluyeron en el estudio las puntuaciones de acoplamiento más altas. Todos los datos relativos a la fuerza de unión, número de interacciones de enlaces de hidrógeno y participación de aminoácidos en las interacciones que se han observado en TNF-α e IL-6 se enumeran en la Tabla 3 y las Figs. 7 y 8.

Representación 2D y 3D de la interacción de 5B2T con TNF-α (PDB ID: 1TNF).

Representación 2D y 3D de la interacción de 5B2T con IL-6 (PDB ID: 1IL6).

La 5-bencilidina-2-tiohidantoína (5B2T) se une a la formación de TNF-α (PDB ID:1TNF); enlaces de hidrógeno con PRO A: 117, TYR C: 119: 116, LYS C: 98, TYR A: 119, ILE C: 118 y con IL-6 (PDB ID: 1IL6) con ARG A: 169, respectivamente. Si bien se observaron interacciones hidrofóbicas entre los enlaces de 5-bencilidina-2-tiohidantoína (5B2T) y TNF-α (ID de PDB: 1TNF) e IL-6 (ID de PDB: 1IL6) con PRO A: 117, ILE A: 118, ALA A:96, PRO B: 117, LEU A:166, LEU A:65 y PRO A:66, respectivamente. La interacción del anión pi se formó con GLU A: 173 y se observó un enlace donador-donante desfavorable entre 5B2T y PHE A; 174 aminoácidos en IL-6 (PDB ID: 1IL6) (Figs. 7 y 8).

La predicción in silico de ADME/T y de similitud con el fármaco de 5B2T se calculó teóricamente a través de admetSAR y SwissADME. El peso molecular 204,25 (g/mol) tiene propiedades de rango ADMET aceptables. Un valor significativo del 78% reveló una alta probabilidad de cruzar la barrera hematoencefálica. El porcentaje de absorción del fármaco intestinal humano 98,73% estuvo en el rango aceptable (> 80). Se encontró que el coeficiente de partición octanol-agua (Log P) de 1,03 es inferior a 5 y no se permite más de una infracción. Se encontró que las áreas de superficie topológica (TPSA) estaban en el rango aceptable (< 140). Además, se encontró que los aceptores de enlaces H (HBA) y los donantes (HBD) estaban en el rango de 3–6 y 2–4, respectivamente (Tabla 4).

En el presente estudio, sintetizamos (Z)-5-bencilideno-2-tioxoimidazolidin-4-ona en condiciones de condensación de Knoevenagel. El espectro de 1H-NMR para 5B2T mostró una señal de singlete típica para el hidrógeno en el doble enlace (CH=C) en δ 6,49 ppm, y los tres protones aromáticos se mostraron en δ 7,45–7,37 ppm como señales múltiples y se mostraron dos protones aromáticos como doblete a δ7,74 ppm (d, J = 7,4 Hz, 2H, phen). No se observaron superposiciones en el espectro de 1H-NMR entre una señal típica para el hidrógeno en el doble enlace y las señales del anillo aromático para 5B2T. El espectro de 13C-NMR mostró señales compatibles con el número de carbonos presentes en 5B2T. Por otro lado, el espectro de 13C-NMR indicó la presencia de un estereoisómero que estaba representado por una señal de carbono de cada átomo de carbono en 5B2T. Bajo las condensaciones de Knoevenagel, los isómeros geométricos E y Z fueron posibles durante las condensaciones de Knoevenagel. Mientras que el espectro de 13C-NMR sugirió un isómero de 5B2T y la configuración de los isómeros Z, lo que sugiere que esta configuración tiene una mayor estabilidad termodinámica debido a un menor impedimento estérico entre el grupo carbonilo y el anillo CH = fenilo21.

DEN es un químico cancerígeno bien conocido y es una toxina hepática aguda para muchos animales de experimentación. Se ha demostrado que la administración prolongada de DEN inicia tumores hepáticos. Una única inyección intraperitoneal de 200 mg/kg de DEN en roedores experimentales puede inducir eficazmente una lesión hepática irreversible22. El principal factor que permite que DEN induzca daño hepático y cáncer es la alta posibilidad de que esta sustancia genere especies reactivas de oxígeno (ROS) que resultan en estrés oxidativo y daño al ADN, lípidos y proteínas. Para que DEN pueda establecer estas acciones, primero debe ser metabolizado por una enzima dentro del cuerpo llamada citocromo p450, lo que hace que DEN produzca altos niveles de ROS que conducen a la peroxidación lipídica de la membrana celular y aductos de ADN a través de la alquilación, lo que resulta en lesión y daño celular. La administración exitosa de DEN en animales de experimentación da como resultado una inducción del 100 % de carcinoma hepatocelular (CHC)23. En este estudio, se empleó una única inyección intraperitoneal de 200 mg/kg de DEN para inducir daño hepático y cáncer en animales de experimentación/ratas macho para evaluar los efectos hepatoprotectores de 5B2T (una molécula similar a un fármaco) en el tratamiento de trastornos hepáticos. Los resultados del análisis bioquímico se muestran en la Fig. 2, en la que es obvio que la administración de DEN causó una elevación sérica notable en los niveles de marcadores bioquímicos hepáticos, incluidas las aminotransferasas (ALT, AST y ALP), como una indicación de hígado lesión e inestabilidad en las actividades metabólicas hepáticas. Esta elevación puede atribuirse a la liberación citoplasmática de estas enzimas a la circulación sanguínea tras la ruptura de la membrana plasmática por el daño celular inducido por DEN24. Se sabe que la aminotransferasa alcalina (ALT), la aspartato aminotransferasa (AST) y la fosfatasa alcalina (ALP) son los biomarcadores bioquímicos séricos más sensibles para el diagnóstico de cualquier discapacidad hepática25. La suplementación oral de 5B2T mostró una fuerte disminución en los niveles de las enzimas séricas que fueron inducidas previamente por DEN. Muchos estudios respaldaron estos resultados e informaron los mismos niveles altos de marcadores bioquímicos del hígado durante la carcinogénesis inducida por DEN, incluido un estudio que evaluó el aceite de ajo contra el HCC inducido por DEN26. Esto sugiere la capacidad de 5B2T para inhibir la progresión tumoral en ratas inducida por DEN, lo que puede atribuirse a la capacidad del tratamiento utilizado para preservar la unidad e integridad de la membrana plasmática de la célula, evitando la fuga de estas enzimas citoplasmáticas desde el interior de la célula. las células al exterior a través de membranas y expresando actividades hepatoprotectoras. Esta también puede ser la razón por la que los marcadores bioquímicos restauraron su actividad después de la administración de 5B2T. También pueden contribuir otros factores, incluido el tipo de metal, el tipo de ligando y sus átomos donantes. Junto con la evaluación bioquímica, este estudio también incluyó la evaluación de la técnica de ensayo de adsorción inmune ligada a enzimas (ELISA) para obtener más ilustraciones de los efectos tanto del inductor como del tratamiento en el hígado. La figura 3 muestra el efecto de 5B2T sobre los niveles de citocinas proinflamatorias TNFα e IL-6. Se observó un fuerte aumento en los niveles séricos de citocinas proinflamatorias en ratas tratadas con DEN, y estos resultados se asociaron con cáncer e inflamación (especialmente TNF-α e IL-6), que se ha documentado que aumentan después de la administración de DEN27 . Por el contrario, las ratas que fueron tratadas con 5B2T revelaron una disminución notable en los niveles de estas citoquinas. El TNF-α media los efectos citotóxicos mediante la expresión de los receptores p55 y p75 en su masa molecular de 55 kDa, lo que induce especies reactivas de oxígeno (ROS) en el fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina de su membrana celular y en las mitocondrias endoteliales. También el TNF-α interrumpe la cadena de transporte de electrones. en el complejo mitocondrial además de la estimulación de la activación del factor nuclear-kappa beta y la regulación al alza de la expresión de IL-628.

Estos hallazgos fueron respaldados por las mejoras histopatológicas e inmunohistoquímicas en las secciones de hígado analizadas. Tras la administración de DEN, los rasgos histológicos característicos del hígado se distorsionaron, desorganizaron y perdieron. Esto puede ocurrir debido a una serie de reacciones, que incluyen estrés oxidativo, pérdida de la integridad de la membrana celular, infiltración de células inflamatorias y la eventual transformación de hepatocitos normales en células tumorales29. La Figura 4 demuestra los resultados histopatológicos. Los resultados microscópicos de las secciones de hígado analizadas histopatológicamente tomadas de ratas tratadas con DEN en la primera duración del experimento revelaron una desfiguración masiva y daños en el hígado, representados principalmente por fibrosis del área portal y dilatación en los sinusoides. Por otro lado, la duración de 6 semanas de la administración de DEN mostró una etapa más grave y avanzada de lesión hepática indicada por infiltración de células inflamatorias en el área de la vena central, dilatación de los canalículos biliares, peliosis y adenoma, lo que respalda los efectos destructivos a largo plazo. de DEN en el hígado. Los mismos resultados se encontraron en un estudio que evaluó el efecto del jengibre contra la hepatotoxicidad inducida por DEN en ratas30, lo que respalda los efectos nocivos de DEN en el hígado. Por el contrario, las secciones de hígado de las ratas tratadas durante 3 semanas con 5B2T mostraron mejoras en la arquitectura general del hígado, con menos células fibróticas e inflamatorias. Al mismo tiempo, las ratas que fueron tratadas durante 6 semanas con 5B2T no solo mostraron inhibición de los efectos destructivos de DEN sino que también mostraron restauración de características histológicas parciales a completas en mayor medida que la primera duración del tratamiento. Además, la evaluación inmunohistoquímica de dos anticuerpos específicos de hígado principales, Ki-67 y HSA, se ilustra en las Figs. 5 y 6. El grupo de placebo mostró tinción negativa de Ki-67 y HSA en el núcleo de las células de tejido analizadas. Las secciones de tejido de las ratas tratadas con DEN revelaron una fuerte tinción positiva para los anticuerpos Ki-67 y HSA durante ambas duraciones del experimento, lo que respalda de manera agresiva los efectos perniciosos de DEN en los hepatocitos. En un estudio realizado para evaluar Ki-67 en CHC inducido por DEN en ratas, se observó un aumento significativo en el número de células positivas para Ki-67 después de la inducción de DEN31. El tratamiento con 5B2T mostró resultados interesantes que mejoraron el pronóstico, reflejando la alta eficacia del químico para curar una etapa avanzada de daño hepático. Las secciones de hígado analizadas para HSA de las ratas tratadas durante 3 y 6 semanas demostraron una tinción positiva débil en el citoplasma de los hepatocitos afectados. Al comparar estos resultados con la evaluación Ki-67, se encontraron resultados más interesantes que sugieren que una mayor duración del tratamiento tiene una relación directamente proporcional con el aumento de la eficacia del fármaco, independientemente de la dosis administrada (es decir, con la estabilidad de la dosis del fármaco) . Las secciones analizadas de las ratas tratadas durante 3 semanas con 5B2T mostraron pocos núcleos teñidos positivamente con Ki-67 Abs; por el contrario, los resultados de la duración del tratamiento de 6 semanas mostraron una tinción negativa total con Ki-67 Abs. Las capacidades de curado observadas de este derivado único del grupo de moléculas similares a fármacos de la tiohidantoína pueden atribuirse a su posesión de un centro estereogénico en su quinta posición32. Sin embargo, también se cree que estos derivados químicos de la tiohidantoína son capaces de bloquear los receptores de inflamación y lesión del hígado, así como inhibir su expresión. Por ejemplo, se cree que los derivados de la 2-tiohidantoína tienen un papel importante en la actividad inhibidora de enzimas importantes, como la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NAPDH) oxidasa (NOX), que tiene un papel importante en el ciclo de Krebs y en la determinación del huésped. la defensa frente a la inflamación, así como la señalización celular, y la isocitrato deshidrogenasa (IDH), que tiene un papel fundamental en el ciclo del ácido tricarboxílico10. El grupo de las tiohidantoínas es ampliamente conocido por sus usos farmacológicos como agentes antimicrobianos y anticancerígenos, especialmente derivados de la 2-tiohidantoína, debido a su baja toxicidad para las células humanas. Como se mencionó anteriormente, el derivado 5B2T es una opción valiosa y prometedora que puede usarse en el futuro como tratamiento para los trastornos hepáticos debido a su fácil preparación y, más importante, a la posesión de un centro estereogénico en la quinta posición33. El sitio de unión más alto (-7,1 kcal/mol) sugiere una fuerte afinidad por el sitio de unión para la interacción de 5B2T con TNF-α. 5B2T establece tres enlaces de hidrógeno con GLU B161, GLU C: 116 y PRO100 y un enlace hidrofóbico con GLU173. El sitio de unión de IL-6 (PDB ID: 1IL6) y la interacción 5B2T tiene una energía de sitio de unión significativa de -6,1 (Kcal/mol) y establece un enlace de hidrógeno con SER170 y tres enlaces hidrofóbicos con LEU 65, 166 y PRO 66. Se encontró que el análisis ADMET para 5B2T era compatible con la regla de cinco (RO5) para moléculas similares a fármacos según Lipinski y su equipo34. El peso molecular es < 500/gmol que obedece al rango de referencia. El valor de la barrera hematoencefálica (BBB) + describe la capacidad del compuesto para cruzar la BBB, que está en los rangos permitidos. Se encontró que las áreas superficiales topológicas (TPSA), log p, aceptores de enlaces H (HBA) y donantes (HBD) estaban en un rango aceptable. Los valores muestran que 5B2T puede ser absorbido por el intestino humano y es un compuesto no tóxico y no cancerígeno. Todos los valores revelaron que 5B2T cumple con las reglas de la regla de cinco de Lipinski (Ro5) y Veber, 4. Los resultados prometedores para 5B2T indican que pueden usarse como candidatos a fármacos. En este estudio, se empleó una inyección intraperitoneal única de 200 mg/kg de DEN para inducir daño hepático y cáncer en animales de experimentación/ratas wistar macho, para la evaluación de los efectos hepatoprotectores de la 5-bencilidina-2-tiohidantoína química (producto químico similar a un fármaco). molécula) en el tratamiento de trastornos hepáticos, la Fig. 9 resume el experimento. La administración de Tween 80% al 10% se consideró como control del estudio. Las ratas tratadas con DEN causaron una lesión hepática masiva que, en particular, causó la elevación de los marcadores bioquímicos del hígado (bilirrubina total, bilirrubina directa, bilirrubina indirecta, alanina aminotransferasa, aspartato aminotransferasa y fosfatasa alcalina) junto con la elevación de las citocinas proinflamatorias (factor de necrosis tumoral-alfa e interleucina-6) y se detectaron niveles altos de anticuerpos HAS y ki-67, lo que eventualmente resultó en la pérdida de la arquitectura hepática. Las ratas tratadas con 5-bencilidina-2-tiohidantoína restauraron notablemente las funciones y la arquitectura hepáticas que se representaron en la disminución de los mismos marcadores hepáticos. Estos resultados respaldan firmemente las características terapéuticas de oro del tratamiento y las prometedoras actividades hepatoprotectoras.

El efecto de la 5-bencilidina-2-tiohidantoína sobre la lesión hepática inducida por dietilnitrosamina. DEN: dietilnitrosamina, TNFα: factor de necrosis tumoral alfa e IL-6: interleucina 6. TB: bilirrubina total, DB: bilirrubina directa, AST: acetato aminotransferasa, ALT: alanina aminotransferasa, ALP: fosfatasa alcalina.

Experimentalmente, la sustancia química sintetizada (5-bencilrdina-2-tiohidantoína) estableció claramente propiedades curativas contra la lesión hepática inducida representada por marcadores bioquímicos hepáticos, citocinas proinflamatorias (TNF-α e IL-6) y hallazgos inmunohistoquímicos. Además, los resultados del acoplamiento molecular mostraron una fuerte unión con alta energía en diferentes sitios entre la 5-bencilidina-2-tiohidantoína y las citocinas proinflamatorias, lo que demuestra la eficacia de la sustancia química como tratamiento hepático.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Departamento de Farmacognosia, Facultad de Farmacia, Universidad Médica Hawler, Erbīl, 44001, Iraq

Lana S. Akree y Zahra A. Amin

Departamento de Química Farmacéutica, Facultad de Farmacia, Universidad Médica Hawler, Erbīl, 44001, Iraq

Hiwa O. Ahmad

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HO preparó la sustancia química, LA realizó el experimento con animales, LA y ZA analizaron los datos, LA escribió el manuscrito, ZA y HO revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Zahra A. Amin.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Akree, LS, Amin, ZA & Ahmad, HO Actividad hepatoprotectora in silico e in vivo de la 5-bencilideno-2-tiohidantoína sintetizada contra la lesión hepática inducida por dietilnitrosamina en un modelo de rata. Informe científico 13, 4681 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-27725-x

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Recibido: 16 junio 2022

Aceptado: 06 enero 2023

Publicado: 22 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27725-x

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